关于散发性结直肠癌组织APC突变的研究的原因,关于散发性结直肠癌组织APC突变的研究的相关知识。 1中国人民解放军广州军区广州总医院肿瘤科 广东省广州市 510010
2中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化病研究所 广东省广州市 510515
项目负责人 林金容中国人民解放军广州军区广州总医院肿瘤科 广东省广州市 510010
收稿日期 1999-04-08 接收日期 1999-06-13
Subject headings colorectal neoplasms; adenomatous polyposis coli gene; mutation; tumor suprresor gene; PCR-SSCP
主题词 结肠直肠肿瘤；家族性腺瘤性息肉病基因；突变；抑癌基因；PCR-SSCP
结直肠癌是我国常见的胃肠道恶性肿瘤，近年来发病率有逐年上升趋势. 在美国，每年死于结直肠癌的患者约有55000. 目前结直肠癌的确切病因仍不清楚，与环境、饮食及遗传等因素均有一定的关系. 家族性腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli gene, APC)为家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)的致病基因[1]，与散发性结直肠癌的关系仍不很清楚，本文应用银染聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)检测散发性结直肠癌新鲜组织中APC突变，旨在研究中国人散发性结直肠癌与APC突变的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 APC引物为APC第11外显子，参照文献合成[2]，由南方医院基因诊断中心合成. 引物序列如下：上游引物为：5＇-GGA CTA CAG GCC ATT GCA GAA-3＇，下游引物为：5＇-GGC TAC ATC TCC AAA AGT CAA-3＇，蛋白酶K购自Sigma公司. Taq DNA聚合酶购自Promega公司. PCR扩增仪购自美国Perkin Elmer Cetus公司，SSCP电泳仪购自Bio-Rad公司. 41例散发性结直肠癌组织为我院及南方医院普通外科1996-10/1997-05手术切除标本. 男21例，女20例，年龄28岁～73岁，平均52岁. 其中高分化腺癌13例，中分化腺癌17例，低分化腺癌11例. Dukes分期：A期13例，B期16例，C期7例，D期5例. 伴淋巴结转移12例，无淋巴结转移29例. CEA升高8例，CEA正常33例.
1.2 新鲜组织DNA提取 手术切下组织后，立即取肿瘤组织及远离肿瘤正常组织各一块，-80℃冰箱保存. DNA提取按照常规酚-仿-异戊醇方法略为改进[3]. 简述如下：取一小块冰冻组织于1.5mL Eppendorf管中，加入0.5mL细胞裂解液及100mg/L蛋白酶K，37℃反应过夜，10000rpm/min离心15min，弃沉淀，加入1mL平衡酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000/min离心15min，弃沉淀，加入2.5倍过量预冷无水乙醇，-20℃放置1h，10000/min离心15min，自然凉干，加入DDH2O溶解后即可用于PCR. 取4μL DNA提取液加入到含30μL PCR反应物(含10mmol/LTris-HCl, 50mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl2，dATP,dTTP,dCTP及dGTP各200μmol/L)的0.5mL EP管中，并加入上、下游引物各7.5pmol/L. 然后97℃变性8min，80℃下加入Taq DNA聚合酶0.75U，进入以下循环：94℃ 40s，56℃ 30s，72℃ 30s，共35循环，最后72℃延伸7min. 10μL PCR反应产物于25g/L琼脂糖凝胶上电泳，60V，30min. SSCP分析 参照Orita方法加以改进[4]. 具体操作如下：12μL上样缓冲液(含980g/L甲酰胺，20mmol/L EDTA，少量二甲苯青及溴酚蓝)与6μL PCR反应产物混匀后，97℃变性8min，冰上骤冷后加入到预冷的80g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=19∶1)，400V，室温下电泳4h，取下凝胶100mL/L乙醇固定10min，蒸馏水漂洗3次，10g/L硝酸脱色3min，蒸馏水漂洗3次，10g/L硝酸银染色10min蒸馏水漂洗3次，显影液显影至结果满意为止，100mL/L乙醇10min，制成干胶，照相. 血清CEA测定 应用放射免疫方法，参照试剂盒说明书测定.
统计学处理 χ2检验.
2 结果
紫外线下可以观察到143bp的橙黄色萤光带，即为阳性结果. 肿瘤组织与正常组织PCR扩增产物经过加热变性后形成单链，比较两者之间单链的泳动速度，若出现带的异常(如多带、少带或带的移动速度发生变化)出现，即可以认为该肿瘤组织发生了突变. 本组16例出现带的异常，即发生了APC突变(图1). 与正常组织比较，1T多了一条带，3T少了一条带，表明二者均发生了点突变，2T，4T则无异常移动带，所以不发生点突变. 根据肿瘤组织学类型、Dukes分期、有无淋巴结转移，分析它们与APC突变的关系， 结果见表1.
表1 APC基因突变与临床病理的关系
aP<0.05，vs 高分化.
图1 SSCP结果，N表示正常组织对照，T为肿瘤组织，DS为双链对照，1T比1N多一条带，3T比3N少一条带， 箭头所示. 2T，4T无异常带.
3 讨论
5q21基因的等位缺失是至今为止在散发性结直肠癌中发现的最早期改变的基因，在小至0.5cm的腺瘤中也发现5q21基因的改变，所以与ras基因一起被认为是结直肠癌发生的促发事件[5，6]. 把5q染色体导入结直肠癌细胞系中，能够有效地抑制肿瘤细胞的生长速度、集落形成及裸鼠体内致瘤作用，说明APC基因为一种肿瘤抑制基因. APC基因是散发性结直肠癌常见变化基因之一，发生率约35%～45%[7]. 散发性结直肠腺瘤中，5q21的杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)发生率为29.0%. 我们应用银染PCR-SSCP检测散发性结直肠癌组织APC第11外显子突变，突变率为39.0%，表明APC基因突变不仅与FAP的发病有关，还是散发性结直肠癌常见变化基因. 本文还提示APC突变发生于结直肠癌的各期，但与结直肠癌的临床分期关系不大. Dukes’分期中A，B，C，D期的突变率分别为30.8%，37.5%，42.9%及60.0%(P>0.05). 有人报道APC突变可能与结直肠癌的恶性程度有关，与本文结果不相一致，本组高分化腺癌的APC突变率显著高于中低分化腺癌中的APC突变率(0.01
目前检测基因突变的方法有多种，如：RNA酶保护法、DNA测序法、温度梯度凝胶电泳等. 其中PCR-SSCP是1989年由Orita et al首先报道. 由于该方法具有操作快速简便，灵敏度高且不需要贵重仪器等优点，现已被广泛应用于基因突变的研究.
4 参考文献
1 Nishisho I, Nakamura Y, Miyoshi Miki Y, Ando H, Horii A, Koyama K, Utsunomiya J, Baba S, Hedge H, Markham A, Krush AJ,Petersen G, Hamilton SR, Nilbert MC, Levy DB, Bryan TM, Preisinger AC, Smith KJ, Su LK, Kinzler KW, Vogelstein B.
Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science, 1991;253:665-669
2 Tamura G, Maesawa C, Suzuki Y, Ogasawara S, Terashima M, Saito K, Satodate R. Primary gastric carcinoma cells frequently
lose heterozygosity at the APC and MCC genetic loci. Jpn J Cancer Res, 1993;84:1015-1018
3 姜泊，张亚历，周殿元，主编. 分子生物学常用实验方法. 北京：人民军医出版社，1996：65
4 Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the
polymerase chain reaction. Genomics, 1989;5:874-879
5 Kinzler KW, Nilbert MC, Vogelstein B, Bryan TM, Levy DB, Smith KJ. Identification of a gene located at chromosome 5q21 that
is mutated in colorectal cancers. Science, 1991;251:1366-1370
6 Gerds H, Chen Q, Hlahi AH, Sircar A, Goldberg E, Winawer D, Urmacher C, Winawer SJ, Jhanwar SC. Recurrent deletions
involving chromosomes 1, 5, 17 and 18 in colorectal carcinoma: possible role in biological and clinical behavior of tumours.
Anticancer Res, 1995;15:13-24
7 Miki Y, Nishisho I, Miyoshi Y, Horii A, Ando H, Nakajima Y, Utsunomiya J, Nakamura Y. Frequent loss of heterozygosity at the MCC
locus on chromosome 5q21-22 in sporadic colorectal carcinomas. Jpn J Cancer Res, 1991;82:1003-1007
2中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化病研究所 广东省广州市 510515
项目负责人 林金容中国人民解放军广州军区广州总医院肿瘤科 广东省广州市 510010
收稿日期 1999-04-08 接收日期 1999-06-13
Subject headings colorectal neoplasms; adenomatous polyposis coli gene; mutation; tumor suprresor gene; PCR-SSCP
主题词 结肠直肠肿瘤；家族性腺瘤性息肉病基因；突变；抑癌基因；PCR-SSCP
结直肠癌是我国常见的胃肠道恶性肿瘤，近年来发病率有逐年上升趋势. 在美国，每年死于结直肠癌的患者约有55000. 目前结直肠癌的确切病因仍不清楚，与环境、饮食及遗传等因素均有一定的关系. 家族性腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli gene, APC)为家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)的致病基因[1]，与散发性结直肠癌的关系仍不很清楚，本文应用银染聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)检测散发性结直肠癌新鲜组织中APC突变，旨在研究中国人散发性结直肠癌与APC突变的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 APC引物为APC第11外显子，参照文献合成[2]，由南方医院基因诊断中心合成. 引物序列如下：上游引物为：5＇-GGA CTA CAG GCC ATT GCA GAA-3＇，下游引物为：5＇-GGC TAC ATC TCC AAA AGT CAA-3＇，蛋白酶K购自Sigma公司. Taq DNA聚合酶购自Promega公司. PCR扩增仪购自美国Perkin Elmer Cetus公司，SSCP电泳仪购自Bio-Rad公司. 41例散发性结直肠癌组织为我院及南方医院普通外科1996-10/1997-05手术切除标本. 男21例，女20例，年龄28岁～73岁，平均52岁. 其中高分化腺癌13例，中分化腺癌17例，低分化腺癌11例. Dukes分期：A期13例，B期16例，C期7例，D期5例. 伴淋巴结转移12例，无淋巴结转移29例. CEA升高8例，CEA正常33例.
1.2 新鲜组织DNA提取 手术切下组织后，立即取肿瘤组织及远离肿瘤正常组织各一块，-80℃冰箱保存. DNA提取按照常规酚-仿-异戊醇方法略为改进[3]. 简述如下：取一小块冰冻组织于1.5mL Eppendorf管中，加入0.5mL细胞裂解液及100mg/L蛋白酶K，37℃反应过夜，10000rpm/min离心15min，弃沉淀，加入1mL平衡酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000/min离心15min，弃沉淀，加入2.5倍过量预冷无水乙醇，-20℃放置1h，10000/min离心15min，自然凉干，加入DDH2O溶解后即可用于PCR. 取4μL DNA提取液加入到含30μL PCR反应物(含10mmol/LTris-HCl, 50mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl2，dATP,dTTP,dCTP及dGTP各200μmol/L)的0.5mL EP管中，并加入上、下游引物各7.5pmol/L. 然后97℃变性8min，80℃下加入Taq DNA聚合酶0.75U，进入以下循环：94℃ 40s，56℃ 30s，72℃ 30s，共35循环，最后72℃延伸7min. 10μL PCR反应产物于25g/L琼脂糖凝胶上电泳，60V，30min. SSCP分析 参照Orita方法加以改进[4]. 具体操作如下：12μL上样缓冲液(含980g/L甲酰胺，20mmol/L EDTA，少量二甲苯青及溴酚蓝)与6μL PCR反应产物混匀后，97℃变性8min，冰上骤冷后加入到预冷的80g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=19∶1)，400V，室温下电泳4h，取下凝胶100mL/L乙醇固定10min，蒸馏水漂洗3次，10g/L硝酸脱色3min，蒸馏水漂洗3次，10g/L硝酸银染色10min蒸馏水漂洗3次，显影液显影至结果满意为止，100mL/L乙醇10min，制成干胶，照相. 血清CEA测定 应用放射免疫方法，参照试剂盒说明书测定.
统计学处理 χ2检验.
2 结果
紫外线下可以观察到143bp的橙黄色萤光带，即为阳性结果. 肿瘤组织与正常组织PCR扩增产物经过加热变性后形成单链，比较两者之间单链的泳动速度，若出现带的异常(如多带、少带或带的移动速度发生变化)出现，即可以认为该肿瘤组织发生了突变. 本组16例出现带的异常，即发生了APC突变(图1). 与正常组织比较，1T多了一条带，3T少了一条带，表明二者均发生了点突变，2T，4T则无异常移动带，所以不发生点突变. 根据肿瘤组织学类型、Dukes分期、有无淋巴结转移，分析它们与APC突变的关系， 结果见表1.
表1 APC基因突变与临床病理的关系
| 临床病理 | APC基因突变n,% |
| 组织学类型 | |
| 高分化腺癌 | 8/13(62) |
| 中分化腺癌 | 5/17(29)a |
| 低分化腺癌 | 3/11(27)a |
| Dukes分期 | |
| A期 | 4/13(31) |
| B期 | 6/16(38) |
| C期 | 3/7(43) |
| D期 | 3/5(60) |
| 淋巴结转移 | |
| 无 | 10/29(35) |
| 有 | 6/12(50) |
| 血清CEA | |
| 升高 | 4/8(50) |
| 正常 | 12/33(36) |
aP<0.05，vs 高分化.
图1 SSCP结果，N表示正常组织对照，T为肿瘤组织，DS为双链对照，1T比1N多一条带，3T比3N少一条带， 箭头所示. 2T，4T无异常带.
3 讨论
5q21基因的等位缺失是至今为止在散发性结直肠癌中发现的最早期改变的基因，在小至0.5cm的腺瘤中也发现5q21基因的改变，所以与ras基因一起被认为是结直肠癌发生的促发事件[5，6]. 把5q染色体导入结直肠癌细胞系中，能够有效地抑制肿瘤细胞的生长速度、集落形成及裸鼠体内致瘤作用，说明APC基因为一种肿瘤抑制基因. APC基因是散发性结直肠癌常见变化基因之一，发生率约35%～45%[7]. 散发性结直肠腺瘤中，5q21的杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)发生率为29.0%. 我们应用银染PCR-SSCP检测散发性结直肠癌组织APC第11外显子突变，突变率为39.0%，表明APC基因突变不仅与FAP的发病有关，还是散发性结直肠癌常见变化基因. 本文还提示APC突变发生于结直肠癌的各期，但与结直肠癌的临床分期关系不大. Dukes’分期中A，B，C，D期的突变率分别为30.8%，37.5%，42.9%及60.0%(P>0.05). 有人报道APC突变可能与结直肠癌的恶性程度有关，与本文结果不相一致，本组高分化腺癌的APC突变率显著高于中低分化腺癌中的APC突变率(0.01
目前检测基因突变的方法有多种，如：RNA酶保护法、DNA测序法、温度梯度凝胶电泳等. 其中PCR-SSCP是1989年由Orita et al首先报道. 由于该方法具有操作快速简便，灵敏度高且不需要贵重仪器等优点，现已被广泛应用于基因突变的研究.
4 参考文献
1 Nishisho I, Nakamura Y, Miyoshi Miki Y, Ando H, Horii A, Koyama K, Utsunomiya J, Baba S, Hedge H, Markham A, Krush AJ,Petersen G, Hamilton SR, Nilbert MC, Levy DB, Bryan TM, Preisinger AC, Smith KJ, Su LK, Kinzler KW, Vogelstein B.
Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science, 1991;253:665-669
2 Tamura G, Maesawa C, Suzuki Y, Ogasawara S, Terashima M, Saito K, Satodate R. Primary gastric carcinoma cells frequently
lose heterozygosity at the APC and MCC genetic loci. Jpn J Cancer Res, 1993;84:1015-1018
3 姜泊，张亚历，周殿元，主编. 分子生物学常用实验方法. 北京：人民军医出版社，1996：65
4 Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the
polymerase chain reaction. Genomics, 1989;5:874-879
5 Kinzler KW, Nilbert MC, Vogelstein B, Bryan TM, Levy DB, Smith KJ. Identification of a gene located at chromosome 5q21 that
is mutated in colorectal cancers. Science, 1991;251:1366-1370
6 Gerds H, Chen Q, Hlahi AH, Sircar A, Goldberg E, Winawer D, Urmacher C, Winawer SJ, Jhanwar SC. Recurrent deletions
involving chromosomes 1, 5, 17 and 18 in colorectal carcinoma: possible role in biological and clinical behavior of tumours.
Anticancer Res, 1995;15:13-24
7 Miki Y, Nishisho I, Miyoshi Y, Horii A, Ando H, Nakajima Y, Utsunomiya J, Nakamura Y. Frequent loss of heterozygosity at the MCC
locus on chromosome 5q21-22 in sporadic colorectal carcinomas. Jpn J Cancer Res, 1991;82:1003-1007