心肌细胞死亡是心肌缺血再灌注后较为严重的不可逆性损伤形式。近来研究显示青年大鼠心肌缺血再灌注性细胞死亡
中除有细胞坏死外
,尚有部分心肌细胞凋亡 ( a p o p t o s i s )。老年大鼠随年龄的增长 ,其体内代谢机能发生一系列变化 ,此时心肌缺血再灌注时心肌细胞损伤 ,尤其是心肌细胞凋亡有何改变 ,目前尚不清楚。丹参作为活血化瘀的药物
对缺血性心脏病有一定的疗效 ,但其对缺血再灌注时心肌细胞凋亡有何影响 ,迄今尚未见文献报道。本研究旨在观察老年
大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡的变化规律 ,并初步探讨复方丹参滴丸对老年大鼠缺血再灌注时心肌细胞凋亡的作用。
材料与方法
1.动物模型 :青年雄性 W i s t a r大鼠 ( 5月龄 ) ,体重 280g～ 350g ;老年雄性 W i s t a r大鼠 ( 22月龄 ) ,体重 400g～ 460g。心肌缺血再灌注模型参照文献方法进行 ,即以 20%乌拉坦腹腔注射麻醉 ( 5m l/k g ) ,气管插管 ,人工通气 ,开胸暴露心脏 ,环绕左冠状动脉 (简称冠脉 )主干标志处穿线 ,相互交叉打结后引出体外备结扎冠脉时用。结扎冠脉后见心电图 S T段立即抬高 ,局部心肌紫绀 (心肌缺血 ) ,一定时间后松扎以恢复冠脉血流(心肌再灌注 )。仅穿线而未结扎者为假手术模型。逐层关胸 ,恢复动物自主呼吸。
2.实验分组 :复方丹参滴丸由天津天士力制药集团有限公司提供。青年及老年大鼠随机分为三组 :( 1)假手术组:生理盐水灌胃 1ml /d ,共四天 ,末次灌胃 1h后行假手术 7h ;( 2)心肌缺血再灌注组 :灌胃 (方法同上 )后行结扎冠脉 1h ,再灌注 6h ;( 3)复方丹参滴丸 ( D S P )组 , D S P以 300m g /k g? d溶于 1m l生理盐水中,灌胃 (方法同上 )后结扎冠脉 1h再灌注 6h。
3.心肌梗死范围测定 :处死动物前再次结扎左冠脉 ,于左室内注入适量 1%伊文氏蓝后取出心脏 ,以 P BS漂洗 ,冰冻 1h ( - 30℃ ) ,去除心房及右室组织 ,心脏横断面切成 2m m的切片 ,于 1% T T C染液中染色 30m i n ( 37℃ ) ,再置于 10%甲醛溶液中以增强染色对比度。以称重法计算心肌缺血危险区 (伊文氏蓝未染区 )、梗死区 ( T TC未染区 )及左室重量 ,心肌梗死范围大小以梗死区重量分别占左室重量与缺血危险区重量的百分比表示。
4.心肌细胞凋亡的原位标记检测 :处死动物前自左室活体灌注含肝素的生理盐水后再灌注 4%多 ( 4℃ )。常规石蜡包埋 ,于心肌梗死中部沿心脏轴线每隔 1m m连续切取数张 5μ m的切片 ,供常规 H E染色及细胞凋亡的原位标记检测。
每一心脏标本取 3个不同部位的切片各 2张按末端脱氧核糖核苷酸转移酶 ( T d T酶 )介导的荧光素 d UT P缺口末端标记法 ( T U N E L )标记心肌凋亡细胞核中 D N A 3’ - O H末端。主要操作步骤为 :切片脱蜡入水后以蛋白酶 K ( 20μ g /m l )消化 15m i n ,以新配制的 1% _ 2O _ 2甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶 ( P O D ) ;0. 1m o l /L P B S漂洗后加入 20μ l T U N E L混合液 (含 T d T酶及荧光素 - d U T P) ,湿盒 37℃孵育 1h , P B S漂洗 ;加 P O D转换液 ,湿盒 37℃孵育 30mi n , P B S漂洗 ;D A B显色 ,苏木素复染 ,封片后光镜观察摄影。上述步骤中不加 T d T酶者作为阴性对照 ;将正常心肌组织以 D N a s e I ( 10μ g /ml )消化以诱导 D N A链断裂 ,然后重复 T U N E L法步骤者作为阳性对照。每张切片选择 5个视野 (明显的坏死区不入选 )计数细胞数 ,以凋亡阳性细胞数占心肌细胞总数的百分比的均值作为心肌细胞凋亡指数 ( A I )。
5.统计学处理 :所有数据以均数±标准基 (■± s )表示 ,多组间两两比较用 q检验。
结果
1.心肌梗死范围的变化 :假手术组均未见心肌梗死现象 ,心肌缺血 1h再灌注 6h后心肌梗死范围明显 ;复方丹参滴丸 ( D S P )能显著缩小心肌梗死范围 ,但老年大鼠心肌缺血再灌注后其心肌梗死范围明显大于青年大鼠 (见表 1)。
2.心肌组织损伤的病理学观察 :依照 Ro a n等方法对心肌病理损伤程度进行分级。青、老年大鼠假手术组均未见明显心肌细胞变性与坏死 ,病理损伤为 0度 ;青年大鼠心肌缺血再灌注组可见部分心肌纤维呈收缩状态 ,心肌细胞浊肿 ,有大片心肌梗死灶 ,偶见坏死灶间连接并累及心室全层 ,病灶损伤为Ⅱ～Ⅲ度 ,而老年大鼠心肌坏死灶间相互连接较多 ,透壁性心肌坏死较明显 ,多为Ⅲ度损伤。 D S P组的心肌损伤程度明显减轻 ,仍存心机坏死改变 ,但坏死灶范围小 ,呈散在性点状分布 ,病变范围多限于心肌内膜下层 ,病理损伤程度多为Ⅰ度。
3.心肌细胞凋亡变化 :经 T U N E L法染色后光镜下凋亡阳性细胞核为深浅不一的棕褐色 ,但细胞轮廓清楚。正常心肌细胞核呈蓝色 ,而坏死区细胞结构模糊一片。因核溶解 ,核 D N A断裂并随机分布而致成片染成棕色。在青年大鼠假手术组仅见极少数散在的心肌凋亡细胞 ,而老年大鼠较青年大鼠为多。青年大鼠心肌缺血再灌注后心肌凋亡细胞增加。 DS P能明显减少心肌凋亡细胞数量。老年大鼠心肌缺血再灌注后心肌凋亡细胞明显比青年大鼠增加 , D SP抑制其缺血再灌注后心肌细胞凋亡的作用也强于青年大鼠 (见表 2)。
讨论
机体的老化伴随着一系列体内代谢机能的改变。研究表明老年大鼠对缺血等有害刺激的适应性和反应性较青年大鼠相同的心肌缺血再灌注时间 ,老年大鼠心肌梗死范围较青年大鼠增大 ,且其心肌组织的病理损伤程度也较重。提示青、老年大鼠对心肌缺血再灌注损伤的耐受性存在着一定的差异。
新近研究提示心肌缺血后凋亡细胞多位于心肌缺血坏死区的周围 ,与细胞坏死一样 ,可能凋亡细胞的数量也与心肌缺血后梗死范围的大小有关。心肌缺血或再灌注后心肌组织中氧自由基产生增加 ,心肌细胞内钙超载 ,位于心肌梗死区周围的心肌细胞可能因受氧自由基或 /和细胞钙超载长期作用而发生细胞凋亡。本研究显示青年大鼠假手术组仅见极少数散在心肌凋亡细胞 ,老年大鼠心肌凋亡细胞相对较多 ,但心肌缺血再灌注后 ,青、老年大鼠心肌凋亡细胞数量明显增多 ,尤其以老年大鼠增加更为显著 ,表明大鼠心肌缺血再灌注时 ,部分心肌细胞发生凋亡 ,而老年大鼠的耐受性较差 ,更易导致细胞凋亡的发生。这可能与老年大鼠体内超氧化物歧化酶 ( S OD )活性较低 ,心肌钙通道活性、磷脂代谢与氧自由基消除能力下降有一定关系。
复方丹参滴丸 ( DS P )这一新型制剂 ,主要由丹参、三七、冰片组成 ,其中以丹参的水溶性成份―丹参素最为重要。
已有研究提示丹参可明显降低冠心病患者血清中脂质过氧化物 ( L P O )浓度 ,提高 S O D活性 ,具有抗缺血、缺氧、清除氧自由基、保护心肌细胞功能的作用。
本研究不仅表明 DS P可缩小青、老年大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死范围 ,减轻心肌组织的病理损伤程度 ,而且首次证实 D S P能明显降低心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数 ,显示 D S P对心肌缺血灌注损伤的保护作用可能部分与其抑制心肌细胞凋亡有关。此外 ,本资料还表明尽管老年大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡多于青年大鼠 ,但 D S P对老年大鼠心肌细胞凋亡的抑制效应强于青年大鼠 ,提示 D S P用于老年机体心肌缺血性疾病的治疗可能获益更大。
本研究认为 ,与青年大鼠比较 ,老年大鼠心肌缺血再灌注后不仅心肌梗死范围较大 ,心肌病理损伤较重 ,且心肌细胞凋亡明显增多。 D SP除能缩小老年大鼠缺血再灌注后心肌梗死范围外 ,尚可显著减少心肌细胞凋亡 ,其对老年大鼠心肌细胞凋亡的干预作用较青年大鼠更为明显。
形成规模产业的复方丹参滴丸
在市场竞争日渐激烈的今天 ,在林林总总的企业中 ,无一不是以规模产生效益。建立于 19 9 4年的天津天士力集团,从一个名不见经传的小厂 ,到 5年后成为天津市医药行业利润排名第 2的龙头企业 ,被列入天津市 13项重大产业科技项目之一。
天士力集团的发展经历体现了一个企业对科学技术的重视。天士力制药集团坚持以高科技为核心 ,始终认为高科技对企业的发展十分重要。作为一个中医药企业 ,困扰其发展的最大问题是中药产品其药效成分说不清 ,产品的质量不易控制,这是中药长期在国际上得不到认可的重要原因。
天津中医学院张伯礼教授说 :“复方丹参滴丸通过美国食品与药物管理局 ( F D A )审查 ,允许进行临床 ,这是一个里程碑式的贡献 ,这说明我们中药只要认认真真去做 ,就可以堂堂正正走向世界。”
天士力制药集团之所以可以通过 F D A是因为它按国际药品质量管理规范 ( G M P )标准生产每一批药品 ,从药材的种植、采集、加工、提炼 ,直到生产 ,每一步都按 G M P标准进行。
天士力集团的领导是这样构划企业的 :现阶段 ,主要完成三项任务 :第一 ,参与国际化的大竞争 ,因为天然植物药的研究是全球性的 ,我们要大力发展 ,与西方发达的医药企业去竞争 ;第二 ,在竞争过程中 ,要继承与坚持我们的优秀文化 ;第三 ,大力开展创新 ,建立起全国性的研究机构。
21世纪将是以科技为先导的新纪元 ,天士力集团将利用传统医学 ,结合现代高科技 ,为人类健康做出自己的贡献。
（来源：777健康网）