关于双PAP法显示胃肠道促胃液素释放肽细胞的原因,关于双PAP法显示胃肠道促胃液素释放肽细胞的相关知识。 项目负责人:赵荣华，男，1963-10-29生，上海市人，汉族。1986年第二军医大学军医系毕业，临床医学博士，普外科主治医师，讲师。发表论文及综述等8篇。[上海市凤阳路415号，电话(021) 3275997-386，传真(846) 21-275629](1994-09-27 收稿 1994-11-14 修回)
Study on the gastrin-releasing peptide cells in gastrointestinal tractby double PAP staining
Rong-Hua Zhao1, Yuan-He Wang1, Ting-Jun Ye2, Yong-Lian Chen2 and Han Gao1
1Department of General Surgery,
2Department of Pathology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003 China
AbstractAIM To study on the gastrin-releasing peptide (GRP) cells in the mucosas of gastric antrum and duodenum immunocytochemically, and evaluate the quality of double PAP method.
METHODS PAP and double PAP immunocytochemical stianing.
RESULTS Most GRP cells located in the middle and lower part of gastric/duodenal adenous tube, and the double PAP method improved the positive staining effect significantly.
CONCLUSION Double PAP immunocytochemical staining is a bettermethod to show the GRP cells in gastrointestinal tract.
Subject headings gastrointestinal hormones; immunocytochemistry; stomach; duodenum
Zhao RH, Wang YH, Ye TJ, Chen YL,Gao H.Study on the gastrin-releasing peptidecells in gastrointestinal tract by double PAP staining.Xin XiaohuabingxueZazhi,1995；3(2)：67-68
摘要
目的 研究胃窦及十二指肠粘膜中促胃液素释放肽(GRP)细胞的免疫细胞化学染色方法，并评价其效果。
方法 PAP法及双PAP法。
结果 GRP细胞主要位于胃腺及十二指肠腺管中下部。双PAP法可大大提高染色阳性强度。
结论 双PAP法是显示胃肠道GRP细胞的较好方法。
主题词 胃肠激素；免疫细胞化学；胃；十二指肠
赵荣华,王元和,叶挺军,陈咏莲,高瀚.双PAP法显示胃肠道促胃液素释放肽细胞.新消化病学杂志，1995；3(2)：67-68
促胃液素释放肽(GRP)是一个重要的胃肠激素[1]。由于GRP细胞在消化道中含量不多，分布较散，且GRP易遭肽酶分解破坏等原因，用常规PAP法行免疫细胞化学观察常难获得满意结果。我们采用双PAP法对胃窦及十二指肠粘膜中的GRP细胞行免疫细胞化学染色，结果较为理想。
1 材料和方法
1.1 切片制备 手术切除的新鲜胃十二指肠标本4例，分别切取胃窦部及十二指肠球部粘膜各1条(约1cm×3cm)。立即置于4℃，10%中性福尔马林中固定24h，常规脱水。渗腊后低温石蜡包埋。4μm连续切片10张，烤干后，脱腊、水化。分别行PAP(5张)和双PAP(5张)染色。
1.2 PAP法 ①切片置0.3%H2O2 甲醇中处理30min，室温；②Tris液(pH=7.5)振洗5min(3次)；③1:6小牛血清处理切片30min，室温；④吸去血清，将稀释成1:50，1:100，1:200和1:400的兔抗人GRP抗体(Dako)分别滴加于4张切片，另1张切片加双蒸水作阴性对照，室温下反应18h；⑤同②；⑥加羊抗兔IgG抗体(1:40，上医病解教研室产品)，于37下反应1h；⑦同②；⑧加PAP复合物(1:100，上医病解教研室产品)，37、45min；⑨同②；⑩ DAB-H2O2显色5min；⑾水洗净；⑿苏木素染核；⒀脱水，透明，封片。
1.3 双PAP法 ①同PAP法①-⑨；②同PAP法中③；③同PAP法⑥-⒀。双PAP法中，0.3%H2O2甲醇封闭延长至40min;小牛血清封闭改在37下反应30min；二抗和PAP复合物反应时间分别缩短至30min和25min。
2 结果
GRP细胞主要位于胃腺及十二指肠腺管中下部，分布呈灶性高密度区。细胞体积大，杯状，富含胞浆；核位于基部，着色较浅。图1和图2分别表示在-抗浓度为1:100时对胃粘膜GRP细胞行PAP和双PAP染色的效果。在不同-抗稀释度下PAP法和双PAP法对胃及十二指肠粘膜GRP细胞的染色评价见表1和表2。可见双PAP法大大提高了阳性染色程度，且所需-抗工作浓度较低，但伴有非特异染色轻度增加。
图1 胃粘膜，GRP阳性细胞染色模糊(PAP法，-抗工作浓度1:100，×20)
图2 胃粘膜，GRP阳性细胞染色清晰(双PAP法，-抗工作浓度1:100，×40)
表1 PAP和双PAP法对胃窦粘膜GRP细胞染色效果比较
表2 PAP和双PAP法对十二指肠粘膜GRP细胞染色效果比较
3 讨论
双PAP法是对PAP法的重要改进，通过两次连接桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，使之较PAP法、ABC法更加敏感。故双PAP法适用于常规石蜡切片中微量和抗原性减弱的抗原检测[2]。采用双PAP法，我们成功地显示了在组织中含量较少，且所含抗原(GRP)易遭肽酶破坏、抗原性减弱的GRP阳性细胞。但双PAP法除了存在步骤多、需时长等不足之外[2]，我们发现操作中很容易使非特异染色增加。通过延长过氧化氢封闭时间，在37条件下行小牛血清封闭、多重封闭以及缩短二抗和PAP复合物反应时间等措施，可使非特异染色降至最低限度。此外，严格的对照设置也有利于对阳性细胞的判断。 GRP的主要生理作用是促进促胃液素分泌[1]。对它在胃肠道发生病理生理改变过程中的作用，目前所知甚少。采用双PAP法显示胃肠道中GRP细胞，为研究在胃肠道病变时GRP细胞数量、分布、形态以及分泌状态等方面的改变提供了有效手段。
4 参考文献1 王志钧.胃肠激素.北京：科学出版社，1985：312-332
2 戴益民.免疫组织化学和杂交组织化学.上海：第二军医大学病理教研室，1992：112-143
Study on the gastrin-releasing peptide cells in gastrointestinal tractby double PAP staining
Rong-Hua Zhao1, Yuan-He Wang1, Ting-Jun Ye2, Yong-Lian Chen2 and Han Gao1
1Department of General Surgery,
2Department of Pathology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003 China
AbstractAIM To study on the gastrin-releasing peptide (GRP) cells in the mucosas of gastric antrum and duodenum immunocytochemically, and evaluate the quality of double PAP method.
METHODS PAP and double PAP immunocytochemical stianing.
RESULTS Most GRP cells located in the middle and lower part of gastric/duodenal adenous tube, and the double PAP method improved the positive staining effect significantly.
CONCLUSION Double PAP immunocytochemical staining is a bettermethod to show the GRP cells in gastrointestinal tract.
Subject headings gastrointestinal hormones; immunocytochemistry; stomach; duodenum
Zhao RH, Wang YH, Ye TJ, Chen YL,Gao H.Study on the gastrin-releasing peptidecells in gastrointestinal tract by double PAP staining.Xin XiaohuabingxueZazhi,1995；3(2)：67-68
摘要
目的 研究胃窦及十二指肠粘膜中促胃液素释放肽(GRP)细胞的免疫细胞化学染色方法，并评价其效果。
方法 PAP法及双PAP法。
结果 GRP细胞主要位于胃腺及十二指肠腺管中下部。双PAP法可大大提高染色阳性强度。
结论 双PAP法是显示胃肠道GRP细胞的较好方法。
主题词 胃肠激素；免疫细胞化学；胃；十二指肠
赵荣华,王元和,叶挺军,陈咏莲,高瀚.双PAP法显示胃肠道促胃液素释放肽细胞.新消化病学杂志，1995；3(2)：67-68
促胃液素释放肽(GRP)是一个重要的胃肠激素[1]。由于GRP细胞在消化道中含量不多，分布较散，且GRP易遭肽酶分解破坏等原因，用常规PAP法行免疫细胞化学观察常难获得满意结果。我们采用双PAP法对胃窦及十二指肠粘膜中的GRP细胞行免疫细胞化学染色，结果较为理想。
1 材料和方法
1.1 切片制备 手术切除的新鲜胃十二指肠标本4例，分别切取胃窦部及十二指肠球部粘膜各1条(约1cm×3cm)。立即置于4℃，10%中性福尔马林中固定24h，常规脱水。渗腊后低温石蜡包埋。4μm连续切片10张，烤干后，脱腊、水化。分别行PAP(5张)和双PAP(5张)染色。
1.2 PAP法 ①切片置0.3%H2O2 甲醇中处理30min，室温；②Tris液(pH=7.5)振洗5min(3次)；③1:6小牛血清处理切片30min，室温；④吸去血清，将稀释成1:50，1:100，1:200和1:400的兔抗人GRP抗体(Dako)分别滴加于4张切片，另1张切片加双蒸水作阴性对照，室温下反应18h；⑤同②；⑥加羊抗兔IgG抗体(1:40，上医病解教研室产品)，于37下反应1h；⑦同②；⑧加PAP复合物(1:100，上医病解教研室产品)，37、45min；⑨同②；⑩ DAB-H2O2显色5min；⑾水洗净；⑿苏木素染核；⒀脱水，透明，封片。
1.3 双PAP法 ①同PAP法①-⑨；②同PAP法中③；③同PAP法⑥-⒀。双PAP法中，0.3%H2O2甲醇封闭延长至40min;小牛血清封闭改在37下反应30min；二抗和PAP复合物反应时间分别缩短至30min和25min。
2 结果
GRP细胞主要位于胃腺及十二指肠腺管中下部，分布呈灶性高密度区。细胞体积大，杯状，富含胞浆；核位于基部，着色较浅。图1和图2分别表示在-抗浓度为1:100时对胃粘膜GRP细胞行PAP和双PAP染色的效果。在不同-抗稀释度下PAP法和双PAP法对胃及十二指肠粘膜GRP细胞的染色评价见表1和表2。可见双PAP法大大提高了阳性染色程度，且所需-抗工作浓度较低，但伴有非特异染色轻度增加。
图1 胃粘膜，GRP阳性细胞染色模糊(PAP法，-抗工作浓度1:100，×20)
图2 胃粘膜，GRP阳性细胞染色清晰(双PAP法，-抗工作浓度1:100，×40)
表1 PAP和双PAP法对胃窦粘膜GRP细胞染色效果比较
| 染色 | PAP | 双PAP | ||||||
| 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | |
| 阳性染色 | ++ | + | + | + | +++ | +++ | ++ | + |
| 非特异染色 | ± | ± | ± | ± | + | + | + | ± |
表2 PAP和双PAP法对十二指肠粘膜GRP细胞染色效果比较
| 染色 | PAP | 双PAP | ||||||
| 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | |
| 阳性染色 | ++ | + | + | + | +++ | +++ | ++ | + |
| 非特异染色 | ± | ± | ± | ± | ++ | + | + | ± |
3 讨论
双PAP法是对PAP法的重要改进，通过两次连接桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，使之较PAP法、ABC法更加敏感。故双PAP法适用于常规石蜡切片中微量和抗原性减弱的抗原检测[2]。采用双PAP法，我们成功地显示了在组织中含量较少，且所含抗原(GRP)易遭肽酶破坏、抗原性减弱的GRP阳性细胞。但双PAP法除了存在步骤多、需时长等不足之外[2]，我们发现操作中很容易使非特异染色增加。通过延长过氧化氢封闭时间，在37条件下行小牛血清封闭、多重封闭以及缩短二抗和PAP复合物反应时间等措施，可使非特异染色降至最低限度。此外，严格的对照设置也有利于对阳性细胞的判断。 GRP的主要生理作用是促进促胃液素分泌[1]。对它在胃肠道发生病理生理改变过程中的作用，目前所知甚少。采用双PAP法显示胃肠道中GRP细胞，为研究在胃肠道病变时GRP细胞数量、分布、形态以及分泌状态等方面的改变提供了有效手段。
4 参考文献1 王志钧.胃肠激素.北京：科学出版社，1985：312-332
2 戴益民.免疫组织化学和杂交组织化学.上海：第二军医大学病理教研室，1992：112-143