作者：阿拉腾其木格(北京)
[摘要] 目的：在本研究中,我们从近年来研究的，生育在中国西部的几种药用植物如姜黄，木棉树的树皮部，树根部,山豆根等中分离到了诱导凋亡的抗肿瘤活性物质，并对其作用机制进行了探索。方法：将日晒干燥的药材姜黄粉,木棉皮碎块,山豆根,木棉根等,用溶剂法,初步提取并鉴定活性后，用硅胶或HP-20等顺相或逆相外柱分离，用己烷：乙酸乙酯溶剂系统并每步活性跟踪，再用HPLC制备，最终得到在人白血病细胞HL-60等有明显增殖抑制活性的5个单一化合物。利用MAS，NMR等机器分析，鉴定了它们的化学结构。用MTT法，荧光染色法的核的形态变化，电泳的DNA断片检出，FCM的凋亡细胞定量，活性氧，Caspase的关联等方面进行了探讨。结果： 分离得到抗肿瘤活性物质ar-turmerone, Lupeol, Maackiain, Trifolirhizin, 2-0-methylisohemigossylic acid lactone 等5重化合物,确立了它们的分离方法,并鉴定了它们的化学结构.都是已知化合物。用这些抗肿瘤活性物质，处理HL-60细胞时，显示出很强的增殖抑制活性(细胞死)。而且出现了细胞核的形态变化，凋亡小体，DNA断片化，以及由于FCM的sub-G1(凋亡)的显著增加等现象。结论：以上结果说明，其增殖抑制活性与凋亡诱导作用有关联。而凋亡诱导的作用机制有时与活性氧或Caspase途径有关联。
[关键词] 抗肿瘤活性物质；HL-60细胞；凋亡诱导
[中图分类号]R285.x [文献标识码]A [文章编号]1.
本研究由四部分组成，在每部分研究中,先进行了药用植物中活性物质的分离，再对分离到的活性物质的檵能性探索方面了关注了凋亡诱导作用。诱导调亡作用，基本上还是由被处理细胞核的形态变化，DNA ladder 检出等来鉴定的。即，由于调亡诱导作用→染色体的凝缩→细胞核的断片→调亡小体的形成→被吞噬除去，这个流程和对照组正常细胞作比较，与是否捡出调亡小体和DNA ladder的现象而被确认的(图1-1)。
首先介绍有关细胞增殖抑制试验，HL-60，Molt4B, KATOⅢ三种细胞，都是在含有牛血清，penicillinG, Streptmycin的RPMI 1640培养基里培养的。在调整好的培养液里加入样品37℃，CO2 5%的培养条件下培养3天，用血球计算盘计算细胞的数字，用此公式计算细胞增殖抑制率的(图1-2)。
研究项目1. 葁黄中的抗肿瘤活性物质及其作用机制
葁黄(Curcuma Longa L.)主要药用地下块茎部，葁科多年生植物，生育地以中国，印度为中心，广泛分布于世界各地，本次用样品是中国产葁黄。自古作为中药材，有抗炎症，抗胆炎，健胃，抗菌等药效(图1-3)。在本研究中葁黄的己烷抽取物显示出很强的活性，所以对其活性物质的分离，构造鉴定以及其作用机制方面进行了探索。
葁黄中存在的抗肿瘤活性物质的分离：首先将葁黄粉末用己烷抽取，用前面(图1-2)介绍的方法检查其活性，将这具有强活性的部位进一步用己烷：乙酸乙酯溶剂系，硅胶柱分离，得6个部位，其中将活性最强的己烷：乙酸乙酯＝8：2部位进一步用己烷：乙酸乙酯＝9：1的单一溶剂冲洗，根据TLC分析分出A~F的6个部位，将其中活性最强的B部位，再用逆相HPLC，90%甲醇，制备出显示的5个峰，通过活性测定将其中活性最强的BⅡ部位进一步分离，制备出化合物BⅡ来(图1-4)。
化合物BⅡ的结构鉴定：在CDCL3 中，1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, Mass等图谱解析及与文献值[1]比较，认为本化合物是，分子式为C15H20O ，在6位的不奇炭素的旋光度为61.2,Mass为216的叫ar-turmerone的已知化合物(图1-5)。用ar-turmerone 在人白血病细胞HL-60，Molt4B, 胃癌细胞KATOⅢ进行了增殖抑制活性测试，在10μg/ml～ 30μg/ml浓度的检测结果显示，白血病细胞HL-60，Molt4B在30μg/ml浓度下达到近100%的增殖抑制率，活性很强。而KATOⅢ细胞在30μg/ml的浓度下只显示出16.3%的增殖抑制率，活性很弱(表1-1)。
此前提下，进一步为解明对白血病HL-60，Molt4B细胞表示强增殖抑制活性的ar-turmerone的增殖抑制作用机制，检查了其有关诱导调亡方面的作用。首先观察了用 ar-turmerone处理细胞的核的形态变化，与A的非处理对照组细胞相比较，ar-turmerone 30μg/ml时被处理24h的Molt4B细胞的核的形态变化，调亡小体如图示得到了确认(图1-6)。为了从生化学角度进行判断，对另一个具有特征性的现象，即DNA的断片化现象进行了探讨。
在Molt4B细胞和HL-60细胞，同样处理48h，将ar-turmerone的处理浓度从10μg/ml～ 30μg/ml 逐渐增大时，(1)是对照组，(2)的10μg/ml浓度下DNA ladder没有观察到，从(3)的20μg/ml浓度开始到(4)的 30μg/ml ，DNA断片ladder逐渐明了，增多。而对胃癌KATOⅢ细胞，用ar-turmerone时间依赖性的，浓度依赖性的处理都观察不到DNA断片ladder(图1-7)。
白血病细胞HL-60，Molt4B，在相同30μg/ml的浓度下，将处理时间从12h增加到24h时，(1)为对照组，没有DNA ladder出现，(2)的12h处理下，可观察到极少量的DNA ladder，(3)的24h处理下，可以观察到明显的DNAladder(图1-8)。从以上结果得知，化合物ar-turmerone对白血病细胞HL-60，Molt4B的增殖抑制活性的作用机制，从被处理细胞的核的形态变化，DNA ladder被观察到的现象说明与调亡诱导作用有关联。而且，引起调亡的ar-turmerone 具有时间依赖性和浓度依赖性，增加培养时间经过，调亡诱导作用将越强烈。越增加添加浓度，调亡诱导作用将越强烈。
接着，观察了 ar-turmerone 对人正常细胞的影响。将ar-turmerone添加到人正常淋巴球细胞里，其样品添加量是,在HL-60细胞的状态下确实明显能观察到DNA断片ladder的浓度，30μg/ml,甚至增加到40μg/ml时也没能观察到DNA ladder。通过此现象得知, ar-turmerone对人正常淋巴球细胞几乎不产生影响(图1-9)。
小结: 1). 从姜黄己烷抽出物中提取分离并鉴定了抗肿瘤活性物质ar-turmerone的化学结构。2). 本化合物对人白血病细胞HL-60，Molt4B有很强的增殖抑制作用,而对胃癌细胞KATOⅢ 却没有明显的增值抑制作用。 3) 对人白血病细胞HL-60，Molt4B的强增殖抑制活性的作用机制与其凋亡诱导特性有关联。
研究项目2. 存在于木棉皮中的抗肿瘤活性物质及其作用机制
木棉(Gossampinus malabarica L)皮是木棉树的树皮部，如图所示是木棉科的高木,开大红花, 生长在中国西南地区,自古作为中药材被广泛应用,特别是清热,止血等效能自古被熟知(图2-1)。在本研究中,发现木棉皮的95%乙醇提取物对HL-60细胞具有很强的增殖抑制活性,所以决定进行此活性化合物的分离,结构鉴定及其作用机制的探索。
木棉皮中的抗肿瘤活性物质的分离: 首先对显示强活性的木棉皮碎块的95%乙醇提取物进一步用己烷,二氯甲烷,乙酸乙酯,甲醇等溶剂按其极性顺序,各寝泡抽取一周,用HL-60细胞进行增殖抑制活性测定,对其中活性最强的己烷抽取部位进而用己烷:乙酸乙酯溶剂系,进行硅胶柱分离,获得8个部位,再对其中活性最强的部位己烷:乙酸乙酯=9:1部分 ,用逆相HPLC,ODS-5,100%的异丙醇分析并制备,得到3个峰区,进行活性比较得知峰1部位具有强活性.从而对峰1部位进行了分离制备,并将得到的化合物称为化合物1(图2-2)。
化合物1的结构鉴定:在CDCL3 中，1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, Mass等的图谱解析以及与文献值[2]比较，认为本化合物是，分子式为C30H50O，Mass在426, 叫Lupeol的已知化合物(图2-3)。接着采用HL-60细胞，对Lupeol在 75μM到200μM的浓度范围内进行了增殖抑制活性测定，结果，75μM浓度时显示50%的增殖抑制率，150μM浓度时达100%的抑制率，而且显示有浓度依赖关系(表2-1)。
接着对Lupeol处理细胞核的形态变化，在萤光显微镜下进行了观察。结果是，与非处理的对照组细胞比较，从B的50μM，C的75μM，D的100μM的顺序调亡小体得到了确认(图2-4)。
又对Lupeol在HL-60细胞中的DNA ladder进行了探讨。相同处理3日间，HL-60细胞里，将Lupeol添加浓度50μM～150μM内逐渐增加时，50μM浓度时DNA ladder未被观察到，从75μM开始，随浓度增加DNA ladder逐渐增多，变得明了。相同处理浓度100μM时，将处理时间从1天增加到3天时，在第一天处理时，DNA ladder未被观察到。从第2天开始，随着时间的增加DNA ladder逐渐增多，变得明了(图2-5)。
从以上的结果认定，Lupeol对HL-60细胞中的增殖抑制活性的作用机制，由于核形态变化以及DNA ladder被捡出而认为与调亡诱导作用有关联，而且引发调亡诱导的Lupeol的浓度依赖性和时间依赖性也得到了确认。随着作用时间或添加浓度的增加，调亡诱导能会更强化。
进一步对Lupeol处理HL-60细胞的细胞FCM进行了检查。结果是，将添加浓度从50μM～150μM时DNA断片逐渐增加，Hypodiploid细胞%(带有细碎DNA断片的细胞)这样逐渐增多。所以，带有细碎DNA断片的细胞的比列，随着Lupeol的添加浓度的逐渐增加而增多。 (图2-6)。
我们还观察了 Lupeol对人正常细胞的影响。将Lupeol添加到人正常淋巴球细胞里，其样品添加量是,在HL-60细胞的状态下确实明显能观察到DNA ladder的浓度即150μM甚至增加到200μM也没能观察到DNA ladder。通过此现象得知,Lupeol对人正常淋巴球细胞几乎不产生影响(图2-7)。
小结：1)从木棉皮95%的乙醇抽出物分离到了抗肿瘤活性物质Lupeol并进行了结构鉴定。2) 白血病细胞HL-60的增殖抑制活性的作用机制与调亡诱导作用有关联，由于调亡诱导作用而引起了HL-60细胞的增殖抑制作用。
研究项目3. 山豆根中的抗肿瘤活性物质及其作用机制
山豆根(Sophora subprostrata Chen et T)是一种豆科植物的根部，主要生长于中国广东省，药用效能，特别是抗肿瘤作用，解毒，止痛，消炎等作用自古被广为熟知(图3-1)。在本研究中，我们发现，山豆根的85%EtOH抽取物对人白血病细胞HL-60有很强的增殖抑制活性，所以决定分离提取本活性物质，坚定其化学结构以及解明其增殖抑制活性的作用机制。
山豆根中活性物质的分离：首先将显示强活性的80%乙醇抽取物，用HP-20，逆相大柱分离以水，60%甲醇，80%甲醇，100%甲醇，丙酮顺次容出获得5个部位，再将其中活性最强的100%甲醇和80%甲醇两个部位分别于RP-HPLC，ODS-5，流动相为50%的甲醇和85%的甲醇单一溶剂，从两个部位分别，分离到化合物F1和F2(图3-2 )。
化合物F1，F2的结构鉴定：在CDCL3 中，1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, Mass等图谱解析以及与文献值[3] [4]比较，鉴定化合物F1是，分子式为C16H12O5，Mass在284, 叫Maackiain的已知化合物。化合物F2是，分子式为C22H22O10，Mass在446, 叫Trifolirhizin的已知化合物。
通过NMR波谱解析和TLC分析，以及文献检索认为，从结构特性上，化合物Maackiain是化合物Trifolirhizin 的(agulikon) 即，Trifolirhizin是Maackiain3-0-β-D Glucose配唐体(图3-3)。
对化合物Maackiain和Trifolirhizin在HL-60细胞的增殖抑制活性进行了检查。Maackiain：HL-60细胞中，添加浓度15μM～75μM间测定了其增殖抑制活性，结果是，在39.7μM浓度，显示50%的增殖抑制率，75μM时显示100%的抑制率。在化合物Trifolirhizin：HL-60细胞中，添加浓度180μM～315μM间测定了其增殖抑制活性，结果是在190.3μM浓度，显示50%的增殖抑制率，315μM时显示100%的抑制率。而且显示出了浓度依赖性变化，随添加浓度的增加增殖抑制率也增加(图3-4)。
为解明化合物Maackiain和Trifolirhizin在HL-60细胞的增殖抑制活性的作用机制，又探讨了其与调亡诱导作用间的关联。首先Maackiain，在荧光显微镜下观察了Maackiain处理细胞的形态变化，结果是，与非处理的对照组细胞相比，以1)15μM， 2)45μM ，3)75μM的顺序，浓度依赖性的调亡小体得到了确认。其次是，对Maackiain的DNA ladder进行了检查。相同处理3日间，添加浓度从30μM～75μM逐渐增加时，30μM浓度时DNA ladder未被观察到。但从45μM开始，随浓度增加DNA ladder逐渐增多，变得明了。相同处理浓度75μM时，将处理时间从半天增加到3天时，在前半天处理时，DNA ladder未被观察到。从满第1天开始，随着时间的增加DNA ladder逐渐增多，变得明了(图3-5)。同样，先对Trifolirhizin，在荧光显微镜下观察了Trifolirhizin处理细胞的形态变化，结果是，与非处理的对照组细胞相比，以1)225μM，2)270μM ，3)315μM的顺序，浓度依赖性的调亡小体得到了确认。其次是，对Trifolirhizin的DNA ladder进行了检查。相同处理3日间，将添加浓度从180μM～315μM逐渐增加时，180μM浓度时DNA ladder未被观察到。但从225μM开始，随浓度增加DNA ladder逐渐增多，变得明了。
相同处理浓度315μM时，将处理时间从1天增加到3天时，在第1天处理时，DNA ladder未被观察到,从第2天开始，随着时间的增加DNA ladder逐渐增多，变得明了(图3-6)。
从以上的结果认为，Maackiain和Trifolirhizin在HL-60细胞的增殖抑制活性的作用机制，与调亡诱导作用有关联，而且引发调亡诱导的Maackiain和Trifolirhizin的浓度依赖性和时间依赖性也得到了确认。随着作用时间或添加浓度的增加，调亡诱导能会更强化。
接着检查了两个化合物对人正常细胞的影响。Maackiain ：将Maackiain添加到人正常淋巴球细胞时，添加量在HL-60细胞的状态下，增殖能被完全抑制住的浓度，确实明显能观察到DNA ladder的浓度，即75μM的浓度，也没能观察到DNAladder。Trifolirhizin ：将Trifolirhizin添加到人正常淋巴球细胞里，其样品添加量是在HL-60细胞的状态下，增殖能被完全抑制住的浓度，确实明显能观察到DNA ladder的浓度，即315μM，也没能观察到DNA ladder。通过这些现象认为，Maackiain和Trifolirhizin对人正常淋巴球细胞几乎不产生影响(图3-7)。
进一步对凋亡诱导作用的作用机制作了探讨。我们知道，化合物Maackiain在75μM浓度时其DNA ladder可清楚地观察到，但与此作对比，其上边添加N-acetyl-L-cystene最终浓度5mM时将不产生DNA ladder。同样，化合物Trifolirhizin在315μM浓度时其DNAladder可清楚地观察到，但与此作对比，其上边添加N-acetyl-L-cystene 最终浓度5mM时将不产生DNA ladder(图3-8)。从此现象我们得知，在用Maackiain和Trifolirhizin处理的HL-60细胞，再添加N-acetyl-L-cystene时，由于产生的活性氧被除去，从而不使DNA断片，观察不到DNA ladder。所以我们认为Maackiain和Trifolirhizin的凋亡诱导作用与其在细胞中产生的活性氧有关联。
小结：1).从山豆根的80%EtOH抽取物中分离得到了在HL-60细胞中有强增殖抑制活性的抗肿瘤活性物质 Maackiain和Trifolirhizin，并鉴定了它们的化学结构。 2). 对于HL-60细胞的增殖抑制活性，化合物 Maackiain要比化合物Trifolirhizin强近5倍。 3).Trifolirhizin是Maackiain的glucose单糖配糖体，它们的增殖抑制活性的作用机制与凋亡诱导作用有关联。而凋亡诱导作用机制又与细胞中产生的活性氧有关联。作为配基的Maackiain，其凋亡诱导能强于带配糖体的Trifolirhizin。
研究项目4. 木棉根中的抗肿瘤活性物质及其作用机制
木棉(Gossampinus malabarica L.)根是前面介绍过的木棉树的根部,生育地是中国广西省,作为中药材被广泛应用,特别是清热,止血，止痛，抗肿瘤等效能自古被熟知(图4-1)。在本项研究中,发现木棉根的己烷提取物对HL-60具有很强的增殖抑制活性,所以决定对此活性化合物进行分离,结构鉴定及其作用机制探索。
木棉根中的抗肿瘤活性物质的分离：首先将显示强活性的己烷抽取物用硅胶柱，己烷：乙酸乙酯溶剂系按顺序洗脱，容出5个部位，将其中活性最强的8：2部位中的可溶性部分，近一步用RP-HPLC，ODS-5，85%甲醇分析，进而制备，分离到化合物A(图4-2)。
对化合物A的结构鉴定：在丙酮中1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, Mass等图谱解析以及与文献值[5]比较，鉴定化合物A为，分子式C16H16O4，Mass在272, 叫2-0-methylisohemigossylic acid lactone的已知化合物(图4-3)。
接着对2-0-methylisohemigossylic acid lactone在HL-60细胞的增殖抑制活性进行了检查。HL-60细胞中，15μg/ml～75μg/ml间测定了其增殖抑制活性，结果是在38μg/ml浓度，显示50%的增殖抑制率，75μg/ml显示100%的抑制率。而且显示了浓度依赖性变化，随添加浓度的增加增殖抑制率也增加(表4-1)。
对2-0-methylisohemigossylic acid lactone处理细胞的核的形态变化，用荧光显微镜进行了观察。结果是，与A的非处理对照组细胞比较，从B的50μg/ml，到C的75μg/ml浓度依赖性的，核形态变化得到了确认(图4-4)。
对2-0-methylisohemigossylic acid lactone 在HL-60细胞中的DNA断片现象进行了探讨。相同处理3日间，HL-60细胞里，将添加浓度从30μg/ml～ 75μg/ml逐渐增加时，30μg/ml浓度DNA ladder未被观察到。从50μg/ml开始，随浓度增加DNAladder逐渐增多，变的明了(图4-5)。相同处理浓度75μg/ml时，将处理时间从1日间增加到3日间时，在第一天处理时，DNA ladder未被观察到。从第2天开始，随着时间的增加DNA ladder逐渐增多，变得明了。
从以上的结果认为，化合物2-0-methylisohemigossylic acid lactone对HL-60细胞中增殖抑制活性的作用机制，由于核形态变化以及DNA ladder被捡出而认为与调亡诱导作用有关联，而且引发调亡诱导的化合物A的浓度依赖性和时间依赖性也得到了确认。随着作用时间或添加浓度的增加，调亡诱导能会更强化。
我们观察了本化合物对人正常细胞的影响。将它添加到人正常淋巴球细胞里，其添加量,在HL-60细胞的状态下确实明显能观察到DNA ladder的浓度即75μg/ml开始，100，甚至增加到125μg/ml也没能观察到DNA ladder。通过此现象认为,本化合物对人正常淋巴球细胞几乎不产生影响(图4-6)。
又对本化合物的调亡诱导作用的作用机制，从活性氧的角度进行了探讨。我们知道，化合物A在75μg/ml浓度时，其DNAladder可清楚地观察到，但与此对比，其上边添加N-acetyl-L-cystene 最终浓度5mM时，DNA ladder依然出现，不受其影响。此现象说明，用化合物A处理HL-60细胞时，再添加N-acetyl-L-cystene即，使产生的活性氧被消除了，核DNA还是会被断片化，DNA ladder依然能被观察到。所以，被认为化合物A的调亡诱导作用不依赖与产生的活性氧，与活性氧没有关联(图4-7)。
对调亡诱导作用的作用机制，又从Caspase关联的角度进行了检查。作为caspase阻害剂，存在于capase cascade上流的，阻害caspase1，4，8，10 的阻害剂Z-VAD-FMK，存在于capase cascade下流的，阻害caspase3，7 的阻害剂Ac-DEVD-CHO, 阻害所有caspase的阻害剂Z-Asp-CH2-DCB ,采用这3种阻害剂，在化合物A上各添加了100μL，结果是，只在化合物A处理下，DNAladder能被观察到，但在其上面添加了Z-VAD-FMK时，DNAladder将观察不到。但在其上面添加了Ac-DEVD-CHO时，相反DNA ladder将明显能观察到。但在上面添加了Z-Asp-CH2-DCB时DNA ladder将观察不到(图4-8)。此现象说明，存在于capase cascade上流的，阻害caspase1，4，8，10 的阻害剂Z-VAD-FMK和阻害所有caspase的阻害剂Z-Asp-CH2-DCB，抑制了化合物A的调亡诱导作用。即认为，在caspase1，4，8，10的哪一部分起了作用，从而抑制了调亡诱导。而存在于capase cascade下流的，阻害caspase 3，7 的阻害剂Ac-DEVD-CHO,起不到任何作用，依然，调亡被诱导，DNAladder被捡出。总之，认为调亡诱导作用是依赖caspase途径的。
小结：1).从木棉根己烷抽出物分离得到了抗肿瘤活性物质2-0-methylisohemigossylic acid lactone并进行了结构鉴定。2),在白血病细胞HL-60的增殖抑制活性的作用机制与调亡诱导作用有关联，而调亡诱导作用机制又与Caspase 1,4,8,10中的某部分有关联。
总结与讨论：1). 从药用植物葁黄，木棉皮，山豆根，木棉根等中，分别分离出主要对人白血病细胞HL-60等有增殖抑制活性的，抗肿瘤活性物质ar-turmerone, Lupeol, Maackiain, Trifolirhizin, 2-0-methylisohemigossylic acid lactone 等5种化合物,确立了它们的分离方法,并鉴定了它们的化学结构。2).以上5种化合物,对人白血病细胞HL-60等有明显的增殖抑制效果,其增殖抑制活性顺序为(IC50) Maackiain: 39.7μM>,ar-turmerone: 55.5μM>, Lupeol:75μM >, 2-0-methylisohemigossylic acid lactone: 139.7μM> ,Trifolirhizin: 190.3μM 。3). 这5种化合物的细胞增殖抑制活性的作用机制,都与凋亡诱导作用有关联。4). 从不同的角度分析, 在Lupeol,其细胞增殖抑制活性的作用机制,从细胞FCM的测定值,可以进一步确定,与凋亡诱导作用有关联。而在Maackiain和 Trifolirhizin, 其细胞增殖抑制活性的作用机制,认为与活性氧有关联的凋亡诱导作用所致。在2-0-methylisohemigossylic acid lactone, 其细胞增殖抑制活性的作用机制,认为与活性氧没有关联,而与caspase有联系的凋亡诱导作用所致。
[参考文献]
[1]Luiza A.F.Ferreira,Olga B.Henriques,Amelia A.S.Andreoni, Glaoclo R.F.Vital,Marcla M.C.Campos,Gerhar G.habermehlandVera L.G.de Moraes. Antivenom and biological effects of ar-turmerone isolated from curcumalonga .Toxicow,vol.30,No10.pp1211-1218. (1992)
[2] Park JA, Kim HJ,Jin C,Lee KT,Lee Ys.,A new pterocarpan, (-)-maackiain sulfate,from the roots of Sophora Subprostrate. Arch pharm Res. 26(12):1009-1013,(2003)
[3] Yoshioki Hayashi, Teruo Shirato,Koichi Sakurai and Toshio Takahashi.,Isoflavanoids from the Heartwood of Millettia pendula benth.Mokuzai gakkaishi Vo1.24,No.12,.898-901(1978).
[4]L.S.Puckhaber and R.D.Stipanovic Revised Structure for a Sesquiterpene Lactone Frome Bombax malbaricum.Journal of Natural Products 64(2),260-261,(2001)
[5]D.weltin,K.Aupeix,C.lltis,J.MCuillerot,P.Dufour,J.
Marchal, and P.Bischoff.N-Acetylcystein Protects Lymphocytes from Nitrogen Mustard-Induced Apoptosis. Biochemical pharmacology, 51,1123-1129,(1996)
[6]Kerr,J.F.,WyllieA.H.and Currie A.R.:Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinatics.,Brit. J.Cancer,26:239-257,(1972)
[7] H.Hibasami,Y.Achiwa,S.Kojima,MHara and T.Komiya.Induction of apoptosis in human stomach cancer cell by green tea catechins.OncologyReport.,Vo1.5,527-529(1998)
[摘要] 目的：在本研究中,我们从近年来研究的，生育在中国西部的几种药用植物如姜黄，木棉树的树皮部，树根部,山豆根等中分离到了诱导凋亡的抗肿瘤活性物质，并对其作用机制进行了探索。方法：将日晒干燥的药材姜黄粉,木棉皮碎块,山豆根,木棉根等,用溶剂法,初步提取并鉴定活性后，用硅胶或HP-20等顺相或逆相外柱分离，用己烷：乙酸乙酯溶剂系统并每步活性跟踪，再用HPLC制备，最终得到在人白血病细胞HL-60等有明显增殖抑制活性的5个单一化合物。利用MAS，NMR等机器分析，鉴定了它们的化学结构。用MTT法，荧光染色法的核的形态变化，电泳的DNA断片检出，FCM的凋亡细胞定量，活性氧，Caspase的关联等方面进行了探讨。结果： 分离得到抗肿瘤活性物质ar-turmerone, Lupeol, Maackiain, Trifolirhizin, 2-0-methylisohemigossylic acid lactone 等5重化合物,确立了它们的分离方法,并鉴定了它们的化学结构.都是已知化合物。用这些抗肿瘤活性物质，处理HL-60细胞时，显示出很强的增殖抑制活性(细胞死)。而且出现了细胞核的形态变化，凋亡小体，DNA断片化，以及由于FCM的sub-G1(凋亡)的显著增加等现象。结论：以上结果说明，其增殖抑制活性与凋亡诱导作用有关联。而凋亡诱导的作用机制有时与活性氧或Caspase途径有关联。
[关键词] 抗肿瘤活性物质；HL-60细胞；凋亡诱导
[中图分类号]R285.x [文献标识码]A [文章编号]1.
本研究由四部分组成，在每部分研究中,先进行了药用植物中活性物质的分离，再对分离到的活性物质的檵能性探索方面了关注了凋亡诱导作用。诱导调亡作用，基本上还是由被处理细胞核的形态变化，DNA ladder 检出等来鉴定的。即，由于调亡诱导作用→染色体的凝缩→细胞核的断片→调亡小体的形成→被吞噬除去，这个流程和对照组正常细胞作比较，与是否捡出调亡小体和DNA ladder的现象而被确认的(图1-1)。
首先介绍有关细胞增殖抑制试验，HL-60，Molt4B, KATOⅢ三种细胞，都是在含有牛血清，penicillinG, Streptmycin的RPMI 1640培养基里培养的。在调整好的培养液里加入样品37℃，CO2 5%的培养条件下培养3天，用血球计算盘计算细胞的数字，用此公式计算细胞增殖抑制率的(图1-2)。
研究项目1. 葁黄中的抗肿瘤活性物质及其作用机制
葁黄(Curcuma Longa L.)主要药用地下块茎部，葁科多年生植物，生育地以中国，印度为中心，广泛分布于世界各地，本次用样品是中国产葁黄。自古作为中药材，有抗炎症，抗胆炎，健胃，抗菌等药效(图1-3)。在本研究中葁黄的己烷抽取物显示出很强的活性，所以对其活性物质的分离，构造鉴定以及其作用机制方面进行了探索。
葁黄中存在的抗肿瘤活性物质的分离：首先将葁黄粉末用己烷抽取，用前面(图1-2)介绍的方法检查其活性，将这具有强活性的部位进一步用己烷：乙酸乙酯溶剂系，硅胶柱分离，得6个部位，其中将活性最强的己烷：乙酸乙酯＝8：2部位进一步用己烷：乙酸乙酯＝9：1的单一溶剂冲洗，根据TLC分析分出A~F的6个部位，将其中活性最强的B部位，再用逆相HPLC，90%甲醇，制备出显示的5个峰，通过活性测定将其中活性最强的BⅡ部位进一步分离，制备出化合物BⅡ来(图1-4)。
化合物BⅡ的结构鉴定：在CDCL3 中，1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, Mass等图谱解析及与文献值[1]比较，认为本化合物是，分子式为C15H20O ，在6位的不奇炭素的旋光度为61.2,Mass为216的叫ar-turmerone的已知化合物(图1-5)。用ar-turmerone 在人白血病细胞HL-60，Molt4B, 胃癌细胞KATOⅢ进行了增殖抑制活性测试，在10μg/ml～ 30μg/ml浓度的检测结果显示，白血病细胞HL-60，Molt4B在30μg/ml浓度下达到近100%的增殖抑制率，活性很强。而KATOⅢ细胞在30μg/ml的浓度下只显示出16.3%的增殖抑制率，活性很弱(表1-1)。
此前提下，进一步为解明对白血病HL-60，Molt4B细胞表示强增殖抑制活性的ar-turmerone的增殖抑制作用机制，检查了其有关诱导调亡方面的作用。首先观察了用 ar-turmerone处理细胞的核的形态变化，与A的非处理对照组细胞相比较，ar-turmerone 30μg/ml时被处理24h的Molt4B细胞的核的形态变化，调亡小体如图示得到了确认(图1-6)。为了从生化学角度进行判断，对另一个具有特征性的现象，即DNA的断片化现象进行了探讨。
在Molt4B细胞和HL-60细胞，同样处理48h，将ar-turmerone的处理浓度从10μg/ml～ 30μg/ml 逐渐增大时，(1)是对照组，(2)的10μg/ml浓度下DNA ladder没有观察到，从(3)的20μg/ml浓度开始到(4)的 30μg/ml ，DNA断片ladder逐渐明了，增多。而对胃癌KATOⅢ细胞，用ar-turmerone时间依赖性的，浓度依赖性的处理都观察不到DNA断片ladder(图1-7)。
白血病细胞HL-60，Molt4B，在相同30μg/ml的浓度下，将处理时间从12h增加到24h时，(1)为对照组，没有DNA ladder出现，(2)的12h处理下，可观察到极少量的DNA ladder，(3)的24h处理下，可以观察到明显的DNAladder(图1-8)。从以上结果得知，化合物ar-turmerone对白血病细胞HL-60，Molt4B的增殖抑制活性的作用机制，从被处理细胞的核的形态变化，DNA ladder被观察到的现象说明与调亡诱导作用有关联。而且，引起调亡的ar-turmerone 具有时间依赖性和浓度依赖性，增加培养时间经过，调亡诱导作用将越强烈。越增加添加浓度，调亡诱导作用将越强烈。
接着，观察了 ar-turmerone 对人正常细胞的影响。将ar-turmerone添加到人正常淋巴球细胞里，其样品添加量是,在HL-60细胞的状态下确实明显能观察到DNA断片ladder的浓度，30μg/ml,甚至增加到40μg/ml时也没能观察到DNA ladder。通过此现象得知, ar-turmerone对人正常淋巴球细胞几乎不产生影响(图1-9)。
小结: 1). 从姜黄己烷抽出物中提取分离并鉴定了抗肿瘤活性物质ar-turmerone的化学结构。2). 本化合物对人白血病细胞HL-60，Molt4B有很强的增殖抑制作用,而对胃癌细胞KATOⅢ 却没有明显的增值抑制作用。 3) 对人白血病细胞HL-60，Molt4B的强增殖抑制活性的作用机制与其凋亡诱导特性有关联。
研究项目2. 存在于木棉皮中的抗肿瘤活性物质及其作用机制
木棉(Gossampinus malabarica L)皮是木棉树的树皮部，如图所示是木棉科的高木,开大红花, 生长在中国西南地区,自古作为中药材被广泛应用,特别是清热,止血等效能自古被熟知(图2-1)。在本研究中,发现木棉皮的95%乙醇提取物对HL-60细胞具有很强的增殖抑制活性,所以决定进行此活性化合物的分离,结构鉴定及其作用机制的探索。
木棉皮中的抗肿瘤活性物质的分离: 首先对显示强活性的木棉皮碎块的95%乙醇提取物进一步用己烷,二氯甲烷,乙酸乙酯,甲醇等溶剂按其极性顺序,各寝泡抽取一周,用HL-60细胞进行增殖抑制活性测定,对其中活性最强的己烷抽取部位进而用己烷:乙酸乙酯溶剂系,进行硅胶柱分离,获得8个部位,再对其中活性最强的部位己烷:乙酸乙酯=9:1部分 ,用逆相HPLC,ODS-5,100%的异丙醇分析并制备,得到3个峰区,进行活性比较得知峰1部位具有强活性.从而对峰1部位进行了分离制备,并将得到的化合物称为化合物1(图2-2)。
化合物1的结构鉴定:在CDCL3 中，1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, Mass等的图谱解析以及与文献值[2]比较，认为本化合物是，分子式为C30H50O，Mass在426, 叫Lupeol的已知化合物(图2-3)。接着采用HL-60细胞，对Lupeol在 75μM到200μM的浓度范围内进行了增殖抑制活性测定，结果，75μM浓度时显示50%的增殖抑制率，150μM浓度时达100%的抑制率，而且显示有浓度依赖关系(表2-1)。
接着对Lupeol处理细胞核的形态变化，在萤光显微镜下进行了观察。结果是，与非处理的对照组细胞比较，从B的50μM，C的75μM，D的100μM的顺序调亡小体得到了确认(图2-4)。
又对Lupeol在HL-60细胞中的DNA ladder进行了探讨。相同处理3日间，HL-60细胞里，将Lupeol添加浓度50μM～150μM内逐渐增加时，50μM浓度时DNA ladder未被观察到，从75μM开始，随浓度增加DNA ladder逐渐增多，变得明了。相同处理浓度100μM时，将处理时间从1天增加到3天时，在第一天处理时，DNA ladder未被观察到。从第2天开始，随着时间的增加DNA ladder逐渐增多，变得明了(图2-5)。
从以上的结果认定，Lupeol对HL-60细胞中的增殖抑制活性的作用机制，由于核形态变化以及DNA ladder被捡出而认为与调亡诱导作用有关联，而且引发调亡诱导的Lupeol的浓度依赖性和时间依赖性也得到了确认。随着作用时间或添加浓度的增加，调亡诱导能会更强化。
进一步对Lupeol处理HL-60细胞的细胞FCM进行了检查。结果是，将添加浓度从50μM～150μM时DNA断片逐渐增加，Hypodiploid细胞%(带有细碎DNA断片的细胞)这样逐渐增多。所以，带有细碎DNA断片的细胞的比列，随着Lupeol的添加浓度的逐渐增加而增多。 (图2-6)。
我们还观察了 Lupeol对人正常细胞的影响。将Lupeol添加到人正常淋巴球细胞里，其样品添加量是,在HL-60细胞的状态下确实明显能观察到DNA ladder的浓度即150μM甚至增加到200μM也没能观察到DNA ladder。通过此现象得知,Lupeol对人正常淋巴球细胞几乎不产生影响(图2-7)。
小结：1)从木棉皮95%的乙醇抽出物分离到了抗肿瘤活性物质Lupeol并进行了结构鉴定。2) 白血病细胞HL-60的增殖抑制活性的作用机制与调亡诱导作用有关联，由于调亡诱导作用而引起了HL-60细胞的增殖抑制作用。
研究项目3. 山豆根中的抗肿瘤活性物质及其作用机制
山豆根(Sophora subprostrata Chen et T)是一种豆科植物的根部，主要生长于中国广东省，药用效能，特别是抗肿瘤作用，解毒，止痛，消炎等作用自古被广为熟知(图3-1)。在本研究中，我们发现，山豆根的85%EtOH抽取物对人白血病细胞HL-60有很强的增殖抑制活性，所以决定分离提取本活性物质，坚定其化学结构以及解明其增殖抑制活性的作用机制。
山豆根中活性物质的分离：首先将显示强活性的80%乙醇抽取物，用HP-20，逆相大柱分离以水，60%甲醇，80%甲醇，100%甲醇，丙酮顺次容出获得5个部位，再将其中活性最强的100%甲醇和80%甲醇两个部位分别于RP-HPLC，ODS-5，流动相为50%的甲醇和85%的甲醇单一溶剂，从两个部位分别，分离到化合物F1和F2(图3-2 )。
化合物F1，F2的结构鉴定：在CDCL3 中，1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, Mass等图谱解析以及与文献值[3] [4]比较，鉴定化合物F1是，分子式为C16H12O5，Mass在284, 叫Maackiain的已知化合物。化合物F2是，分子式为C22H22O10，Mass在446, 叫Trifolirhizin的已知化合物。
通过NMR波谱解析和TLC分析，以及文献检索认为，从结构特性上，化合物Maackiain是化合物Trifolirhizin 的(agulikon) 即，Trifolirhizin是Maackiain3-0-β-D Glucose配唐体(图3-3)。
对化合物Maackiain和Trifolirhizin在HL-60细胞的增殖抑制活性进行了检查。Maackiain：HL-60细胞中，添加浓度15μM～75μM间测定了其增殖抑制活性，结果是，在39.7μM浓度，显示50%的增殖抑制率，75μM时显示100%的抑制率。在化合物Trifolirhizin：HL-60细胞中，添加浓度180μM～315μM间测定了其增殖抑制活性，结果是在190.3μM浓度，显示50%的增殖抑制率，315μM时显示100%的抑制率。而且显示出了浓度依赖性变化，随添加浓度的增加增殖抑制率也增加(图3-4)。
为解明化合物Maackiain和Trifolirhizin在HL-60细胞的增殖抑制活性的作用机制，又探讨了其与调亡诱导作用间的关联。首先Maackiain，在荧光显微镜下观察了Maackiain处理细胞的形态变化，结果是，与非处理的对照组细胞相比，以1)15μM， 2)45μM ，3)75μM的顺序，浓度依赖性的调亡小体得到了确认。其次是，对Maackiain的DNA ladder进行了检查。相同处理3日间，添加浓度从30μM～75μM逐渐增加时，30μM浓度时DNA ladder未被观察到。但从45μM开始，随浓度增加DNA ladder逐渐增多，变得明了。相同处理浓度75μM时，将处理时间从半天增加到3天时，在前半天处理时，DNA ladder未被观察到。从满第1天开始，随着时间的增加DNA ladder逐渐增多，变得明了(图3-5)。同样，先对Trifolirhizin，在荧光显微镜下观察了Trifolirhizin处理细胞的形态变化，结果是，与非处理的对照组细胞相比，以1)225μM，2)270μM ，3)315μM的顺序，浓度依赖性的调亡小体得到了确认。其次是，对Trifolirhizin的DNA ladder进行了检查。相同处理3日间，将添加浓度从180μM～315μM逐渐增加时，180μM浓度时DNA ladder未被观察到。但从225μM开始，随浓度增加DNA ladder逐渐增多，变得明了。
相同处理浓度315μM时，将处理时间从1天增加到3天时，在第1天处理时，DNA ladder未被观察到,从第2天开始，随着时间的增加DNA ladder逐渐增多，变得明了(图3-6)。
从以上的结果认为，Maackiain和Trifolirhizin在HL-60细胞的增殖抑制活性的作用机制，与调亡诱导作用有关联，而且引发调亡诱导的Maackiain和Trifolirhizin的浓度依赖性和时间依赖性也得到了确认。随着作用时间或添加浓度的增加，调亡诱导能会更强化。
接着检查了两个化合物对人正常细胞的影响。Maackiain ：将Maackiain添加到人正常淋巴球细胞时，添加量在HL-60细胞的状态下，增殖能被完全抑制住的浓度，确实明显能观察到DNA ladder的浓度，即75μM的浓度，也没能观察到DNAladder。Trifolirhizin ：将Trifolirhizin添加到人正常淋巴球细胞里，其样品添加量是在HL-60细胞的状态下，增殖能被完全抑制住的浓度，确实明显能观察到DNA ladder的浓度，即315μM，也没能观察到DNA ladder。通过这些现象认为，Maackiain和Trifolirhizin对人正常淋巴球细胞几乎不产生影响(图3-7)。
进一步对凋亡诱导作用的作用机制作了探讨。我们知道，化合物Maackiain在75μM浓度时其DNA ladder可清楚地观察到，但与此作对比，其上边添加N-acetyl-L-cystene最终浓度5mM时将不产生DNA ladder。同样，化合物Trifolirhizin在315μM浓度时其DNAladder可清楚地观察到，但与此作对比，其上边添加N-acetyl-L-cystene 最终浓度5mM时将不产生DNA ladder(图3-8)。从此现象我们得知，在用Maackiain和Trifolirhizin处理的HL-60细胞，再添加N-acetyl-L-cystene时，由于产生的活性氧被除去，从而不使DNA断片，观察不到DNA ladder。所以我们认为Maackiain和Trifolirhizin的凋亡诱导作用与其在细胞中产生的活性氧有关联。
小结：1).从山豆根的80%EtOH抽取物中分离得到了在HL-60细胞中有强增殖抑制活性的抗肿瘤活性物质 Maackiain和Trifolirhizin，并鉴定了它们的化学结构。 2). 对于HL-60细胞的增殖抑制活性，化合物 Maackiain要比化合物Trifolirhizin强近5倍。 3).Trifolirhizin是Maackiain的glucose单糖配糖体，它们的增殖抑制活性的作用机制与凋亡诱导作用有关联。而凋亡诱导作用机制又与细胞中产生的活性氧有关联。作为配基的Maackiain，其凋亡诱导能强于带配糖体的Trifolirhizin。
研究项目4. 木棉根中的抗肿瘤活性物质及其作用机制
木棉(Gossampinus malabarica L.)根是前面介绍过的木棉树的根部,生育地是中国广西省,作为中药材被广泛应用,特别是清热,止血，止痛，抗肿瘤等效能自古被熟知(图4-1)。在本项研究中,发现木棉根的己烷提取物对HL-60具有很强的增殖抑制活性,所以决定对此活性化合物进行分离,结构鉴定及其作用机制探索。
木棉根中的抗肿瘤活性物质的分离：首先将显示强活性的己烷抽取物用硅胶柱，己烷：乙酸乙酯溶剂系按顺序洗脱，容出5个部位，将其中活性最强的8：2部位中的可溶性部分，近一步用RP-HPLC，ODS-5，85%甲醇分析，进而制备，分离到化合物A(图4-2)。
对化合物A的结构鉴定：在丙酮中1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, Mass等图谱解析以及与文献值[5]比较，鉴定化合物A为，分子式C16H16O4，Mass在272, 叫2-0-methylisohemigossylic acid lactone的已知化合物(图4-3)。
接着对2-0-methylisohemigossylic acid lactone在HL-60细胞的增殖抑制活性进行了检查。HL-60细胞中，15μg/ml～75μg/ml间测定了其增殖抑制活性，结果是在38μg/ml浓度，显示50%的增殖抑制率，75μg/ml显示100%的抑制率。而且显示了浓度依赖性变化，随添加浓度的增加增殖抑制率也增加(表4-1)。
对2-0-methylisohemigossylic acid lactone处理细胞的核的形态变化，用荧光显微镜进行了观察。结果是，与A的非处理对照组细胞比较，从B的50μg/ml，到C的75μg/ml浓度依赖性的，核形态变化得到了确认(图4-4)。
对2-0-methylisohemigossylic acid lactone 在HL-60细胞中的DNA断片现象进行了探讨。相同处理3日间，HL-60细胞里，将添加浓度从30μg/ml～ 75μg/ml逐渐增加时，30μg/ml浓度DNA ladder未被观察到。从50μg/ml开始，随浓度增加DNAladder逐渐增多，变的明了(图4-5)。相同处理浓度75μg/ml时，将处理时间从1日间增加到3日间时，在第一天处理时，DNA ladder未被观察到。从第2天开始，随着时间的增加DNA ladder逐渐增多，变得明了。
从以上的结果认为，化合物2-0-methylisohemigossylic acid lactone对HL-60细胞中增殖抑制活性的作用机制，由于核形态变化以及DNA ladder被捡出而认为与调亡诱导作用有关联，而且引发调亡诱导的化合物A的浓度依赖性和时间依赖性也得到了确认。随着作用时间或添加浓度的增加，调亡诱导能会更强化。
我们观察了本化合物对人正常细胞的影响。将它添加到人正常淋巴球细胞里，其添加量,在HL-60细胞的状态下确实明显能观察到DNA ladder的浓度即75μg/ml开始，100，甚至增加到125μg/ml也没能观察到DNA ladder。通过此现象认为,本化合物对人正常淋巴球细胞几乎不产生影响(图4-6)。
又对本化合物的调亡诱导作用的作用机制，从活性氧的角度进行了探讨。我们知道，化合物A在75μg/ml浓度时，其DNAladder可清楚地观察到，但与此对比，其上边添加N-acetyl-L-cystene 最终浓度5mM时，DNA ladder依然出现，不受其影响。此现象说明，用化合物A处理HL-60细胞时，再添加N-acetyl-L-cystene即，使产生的活性氧被消除了，核DNA还是会被断片化，DNA ladder依然能被观察到。所以，被认为化合物A的调亡诱导作用不依赖与产生的活性氧，与活性氧没有关联(图4-7)。
对调亡诱导作用的作用机制，又从Caspase关联的角度进行了检查。作为caspase阻害剂，存在于capase cascade上流的，阻害caspase1，4，8，10 的阻害剂Z-VAD-FMK，存在于capase cascade下流的，阻害caspase3，7 的阻害剂Ac-DEVD-CHO, 阻害所有caspase的阻害剂Z-Asp-CH2-DCB ,采用这3种阻害剂，在化合物A上各添加了100μL，结果是，只在化合物A处理下，DNAladder能被观察到，但在其上面添加了Z-VAD-FMK时，DNAladder将观察不到。但在其上面添加了Ac-DEVD-CHO时，相反DNA ladder将明显能观察到。但在上面添加了Z-Asp-CH2-DCB时DNA ladder将观察不到(图4-8)。此现象说明，存在于capase cascade上流的，阻害caspase1，4，8，10 的阻害剂Z-VAD-FMK和阻害所有caspase的阻害剂Z-Asp-CH2-DCB，抑制了化合物A的调亡诱导作用。即认为，在caspase1，4，8，10的哪一部分起了作用，从而抑制了调亡诱导。而存在于capase cascade下流的，阻害caspase 3，7 的阻害剂Ac-DEVD-CHO,起不到任何作用，依然，调亡被诱导，DNAladder被捡出。总之，认为调亡诱导作用是依赖caspase途径的。
小结：1).从木棉根己烷抽出物分离得到了抗肿瘤活性物质2-0-methylisohemigossylic acid lactone并进行了结构鉴定。2),在白血病细胞HL-60的增殖抑制活性的作用机制与调亡诱导作用有关联，而调亡诱导作用机制又与Caspase 1,4,8,10中的某部分有关联。
总结与讨论：1). 从药用植物葁黄，木棉皮，山豆根，木棉根等中，分别分离出主要对人白血病细胞HL-60等有增殖抑制活性的，抗肿瘤活性物质ar-turmerone, Lupeol, Maackiain, Trifolirhizin, 2-0-methylisohemigossylic acid lactone 等5种化合物,确立了它们的分离方法,并鉴定了它们的化学结构。2).以上5种化合物,对人白血病细胞HL-60等有明显的增殖抑制效果,其增殖抑制活性顺序为(IC50) Maackiain: 39.7μM>,ar-turmerone: 55.5μM>, Lupeol:75μM >, 2-0-methylisohemigossylic acid lactone: 139.7μM> ,Trifolirhizin: 190.3μM 。3). 这5种化合物的细胞增殖抑制活性的作用机制,都与凋亡诱导作用有关联。4). 从不同的角度分析, 在Lupeol,其细胞增殖抑制活性的作用机制,从细胞FCM的测定值,可以进一步确定,与凋亡诱导作用有关联。而在Maackiain和 Trifolirhizin, 其细胞增殖抑制活性的作用机制,认为与活性氧有关联的凋亡诱导作用所致。在2-0-methylisohemigossylic acid lactone, 其细胞增殖抑制活性的作用机制,认为与活性氧没有关联,而与caspase有联系的凋亡诱导作用所致。
[参考文献]
[1]Luiza A.F.Ferreira,Olga B.Henriques,Amelia A.S.Andreoni, Glaoclo R.F.Vital,Marcla M.C.Campos,Gerhar G.habermehlandVera L.G.de Moraes. Antivenom and biological effects of ar-turmerone isolated from curcumalonga .Toxicow,vol.30,No10.pp1211-1218. (1992)
[2] Park JA, Kim HJ,Jin C,Lee KT,Lee Ys.,A new pterocarpan, (-)-maackiain sulfate,from the roots of Sophora Subprostrate. Arch pharm Res. 26(12):1009-1013,(2003)
[3] Yoshioki Hayashi, Teruo Shirato,Koichi Sakurai and Toshio Takahashi.,Isoflavanoids from the Heartwood of Millettia pendula benth.Mokuzai gakkaishi Vo1.24,No.12,.898-901(1978).
[4]L.S.Puckhaber and R.D.Stipanovic Revised Structure for a Sesquiterpene Lactone Frome Bombax malbaricum.Journal of Natural Products 64(2),260-261,(2001)
[5]D.weltin,K.Aupeix,C.lltis,J.MCuillerot,P.Dufour,J.
Marchal, and P.Bischoff.N-Acetylcystein Protects Lymphocytes from Nitrogen Mustard-Induced Apoptosis. Biochemical pharmacology, 51,1123-1129,(1996)
[6]Kerr,J.F.,WyllieA.H.and Currie A.R.:Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinatics.,Brit. J.Cancer,26:239-257,(1972)
[7] H.Hibasami,Y.Achiwa,S.Kojima,MHara and T.Komiya.Induction of apoptosis in human stomach cancer cell by green tea catechins.OncologyReport.,Vo1.5,527-529(1998)